PM小鼠模型構(gòu)建

簡要描述：

PM小鼠模型構(gòu)建：點突變（PM）小鼠模型通過在特定基因中引入單核苷酸改變（如錯義突變、無義突變），精準模擬人類遺傳病突變（如腫瘤驅(qū)動突變、代謝疾病相關SNP），是研究基因功能細微調(diào)控和藥物開發(fā)的理想工具

更新時間：2025-06-26

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廠商性質(zhì)：其他

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產(chǎn)品介紹

一、PM小鼠模型構(gòu)建技術(shù)路線選擇

方法	周期	精度	適用場景
CRISPR-Base Editing	2-3個月	單堿基	C→T或A→G轉(zhuǎn)換（無需DSB）
CRISPR-HDR	3-5個月	任意突變	需設計ssODN供體
ES細胞同源重組	6-12個月	最高	復雜突變（如大片段替換+點突變）

二、PM小鼠模型構(gòu)建CRISPR-HDR方案（當前常用）

1. 靶點設計與工具選擇

gRNA設計：

靶向突變位點附近（距離<10 bp），使用Benchling優(yōu)化特異性。
推薦工具：

單堿基編輯：ABE8e（A→G）或BE4max（C→T）編輯器。
HDR修復：高保真Cas9（如HiFi Cas9） + 化學修飾ssODN供體。

2. ssODN供體設計

5'同源臂 40-60nt

目標突變+沉默突變*

3'同源臂 40-60nt

沉默突變：在PAM序列或gRNA靶區(qū)引入1-2 bp沉默突變（防止供體重切）。
化學修飾：3'端硫代磷酸酯化（增強穩(wěn)定性，IDT可合成）。

3. 受精卵注射

注射混合物：

Cas9 mRNA (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) + ssODN (100 ng/μL)。

胚胎處理：

注射后培養(yǎng)至囊胚期，移植至假孕母鼠。

4. 基因型鑒定

初篩PCR：擴增含突變位點的片段（引物距突變位點>50 bp）。
深度測序：

使用ICE工具分析NGS數(shù)據(jù)，計算HDR效率。
敏感方法：ddPCR檢測低頻突變（<1%）。

5. 品系建立與驗證

傳代驗證：F0可能為嵌合體，需與野生型交配獲得穩(wěn)定遺傳。
功能驗證：

蛋白質(zhì)印跡（檢測突變蛋白表達）。
酶活檢測（如代謝酶突變需測活性）。

三、ES細胞打靶方案（超高精度）

1. 靶向載體構(gòu)建

同源臂設計：5'和3'臂各1.5-2 kb，中間含目標突變。
篩選標記：

正選擇：NeoR（后續(xù)可通過Flp刪除）。
負選擇：DTA（減少隨機整合）。

2. ES細胞篩選與驗證

陽性克隆鑒定：

長片段PCR（擴增整個重組區(qū)域）。
Sanger測序確認突變位點。

3. 小鼠制備

通過囊胚注射獲得嵌合體，與Flp deleter小鼠交配刪除NeoR。

四、Base Editing方案（無DSB風險）

1. 系統(tǒng)選擇

C→T突變：用BE4max + gRNA（靶向C在窗口4-8位）。
A→G突變：用ABE8e + gRNA（靶向A在窗口4-7位）。

2. 效率優(yōu)化

注射濃度：

BE4max mRNA (100 ng/μL) + gRNA (50 ng/μL)。

胚胎基因型：

需檢測旁系編輯（預測工具：BE-Hive)。

五、經(jīng)典案例解析

突變類型	疾病模型	構(gòu)建方法
BRAF V600E	黑色素瘤	CRISPR-HDR + ssODN
TP53 R175H	Li-Fraumeni綜合征	ES細胞同源重組
CFTR ΔF508	囊性纖維化	Base Editing (C→T)

六、常見問題與解決

問題	原因	解決方案
HDR效率低	ssODN穩(wěn)定性不足	使用硫代磷酸酯修飾ssODN
嵌合體突變丟失	生殖系未傳遞	增加F0交配數(shù)量，篩選生殖系傳遞后代
非預期旁系突變	Base Editing脫靶	選擇高特異性gRNA，驗證全基因組脫靶